Dinámica y Cinética de Máquinas Moleculares

Sergio B. Kaufman (Director)
Evelyn Mikkelsen
Fernando Amrein

Estudiar cómo afecta la estabilidad local de la cadena doble de ARN la funcionalidad de la NS3 de dengue en su rol de desestabilizar y separar dichas cadenas de ácidos nucleicos
Mediante experimentos de moléculas individuales (‘single molecule’) determinamos que la NS3 se desplaza y separa hebras dobles de ARN mediante pasos de 10 pares de bases coordinados con sub-pasos de 3 pares de bases siguiendo un mecanismo de movimiento de gusano o ‘inchworm’. Así, determinamos las velocidades de desplegamiento y de locomoción y observamos manifestaciones -indicios- de que la cinética de la NS3 es diferente según si avanza sobre la unión de un par de bases G-C, que si lo hace sobre una A-U. El hallazgo de este efecto conduce a preguntar: ¿podrían aquellas velocidades estar moduladas por barreras cinéticas dependientes de la secuencia del ARN? Es decir, cómo la estabilidad local dada por la composición del sustrato afecta la velocidad de locomoción, la de separación de las cadenas; si la separación se produce por un mecanismo activo o pasivo y si tiene efecto sobre la ‘procesividad’ de la enzima. La forma en que dichas barreras afectan la actividad de la NS3 dependerá del mecanismo del motor, para los que se han propuesto, desde trinquetes brownianos puros (Brownian ratchet) hasta mecanismos de pasos ‘stepping mechanism o power stroke’. El desarrollo experimental que proponemos concretar sumará información adicional útil para discutir en términos de dichos modelos el mecanismo de funcionamiento de la NS3.

Estudiar el ciclo catalítico de hidrólisis de nucleósidos trifosfato por la proteína NS3 del virus del zika en condiciones de estado estacionario
Para establecer el rol funcional de la NS3, sus determinantes y la modulación por agentes químicos y/o bioquímicos es indispensable estudiar la actividad de la enzima en estado estacionario. A diferencia de otros flavivirus, los estudios sobre la NS3 de zika siguen siendo escasos y la información publicada sobre las propiedades catalíticas de hidrólisis de ATP muy pobre. Por lo tanto, proponemos estudiar: 1) las curvas de sustrato de la actividad NTPasa para los nucleótidos canónicos (ATP, GTP, CTP y UTP) y determinar los parámetros cinéticos característicos en cada caso; 2) Establecer la especificidad de la NS3 por la serie de nucleótidos estudiados; 3) Determinar el número de sitios de la proteína donde se produce la catálisis de la hidrólisis de los nucleótidos y establecer la selectividad de los mismos por los diferentes NTP’s; 4) Verificar si el Mg2+ es un activador esencial de la actividad ATPasa y, en cuyo caso, determinar si los cationes divalentes complejantes del ATP: Ca2+, Ba2+, Sr2+, Fe2+, Cu2+y Mn2+ pueden actuar como sustitutos del Mg2+.

Caracterizar los diversos estados conformacionales del complejo NS3h-ARN durante el ciclo catalítico de la NS3
En estudios previos realizados en colaboración con la doctora Mehrnoosh Arrar , investigamos mediante simulaciones computacionales la dinámica conformacional de la NS3h. Partiendo de la estructura cristalográfica de la proteína exploramos dicha dinámica en ausencia y presencia de ATP y en presencia de los productos de hidrólisis cuando se halla unida a un oligonucleótido de ARN de 7 bases de longitud. Aunque estas simulaciones permitieron entender los cambios que se producen entre estados rígidos y flexibles de la NS3h durante el ciclo catalítico, no permitió resolver las diferencias que podrían hallarse cuando la unión del ARN se produce en presencia o ausencia de ATP. Contemplando los resultados termodinámicos de nuestro laboratorio que indican que el sitio de unión de la NS3 al ARN es de 10-11 bases de longitud, proponemos modelar a partir de la estructura cristalográfica de la NS3, la unión de la proteína a oligonucleótidos de ARN de 10-11 bases y superiores de longitud. A partir de estos resultados proyectamos elaborar un modelo atomístico consecuente con los datos experimentales y dilucidar los diversos estados conformacionales del complejo NS3h-ARN que se suceden durante el ciclo catalítico de hidrólisis de ATP.

Adler NS, Cababie LA, Sarto C, Cavasotto CN, Gebhard LG, Estrin DA, Gamarnik AV, Arrar M, Kaufman SB. Insights into the product release mechanism of dengue virus NS3 helicase. Nucleic Acids Res. 2022 Jul 8;50(12):6968-6979. doi: 10.1093/nar/gkac473. PMID: 35736223; PMCID: PMC9262617.

Sarto C, Kaufman SB, Estrin DA, Arrar M. Nucleotide-dependent dynamics of the Dengue NS3 helicase. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2020 Aug;1868(8):140441. doi: 10.1016/j.bbapap.2020.140441. Epub 2020 May 1. PMID: 32371149.

Cababie LA, Incicco JJ, González-Lebrero RM, Roman EA, Gebhard LG, Gamarnik AV, Kaufman SB. Thermodynamic study of the effect of ions on the interaction between dengue virus NS3 helicase and single stranded RNA. Sci Rep. 2019 Jul 22;9(1):10569. doi: 10.1038/s41598-019-46741-4. PMID: 31332207; PMCID: PMC6646317

Gebhard, L. G., Incicco, J. J., Smal, C., Gallo, M., Gamarnik, A. V., & Kaufman, S. B. (2015). Monomeric nature of dengue virus NS3 helicase and thermodynamic analysis of the interaction with single-stranded RNA. Nucleic Acids Research, 42(18), 11668-11686. PubMed

Cattoni DI, Chara O, Kaufman SB, González Flecha FL (2015) Cooperativity in Binding Processes: New Insights from Phenomenological Modeling. PLoS ONE 10(12): e0146043. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146043

Incicco, J. J., Gebhard, L. G., González-Lebrero, R. M., Gamarnik, A. V., & Kaufman, S. B. (2013). Steady-state NTPase activity of Dengue virus NS3: Number of catalytic sites, nucleotide specificity and activation by ssRNA. PloS One, 8(3), e58508. PubMed

Gebhard, L. G., Kaufman, S. B., & Gamarnik, A. V. (2012). Novel ATP-independent RNA annealing activity of the dengue virus NS3 helicase. PLoS One, 7(4), e36244. PubMed

Cattoni, D. I., Kaufman, S. B., & Flecha, F. (2009). Kinetics and thermodynamics of the interaction of 1-anilino-naphthalene-8-sulfonate with proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1794(11), 1700-1708. PubMed

Nuestro grupo de trabajo produce investigación en el área de la biofísica y se halla especializado en la aplicación de herramientas teóricas y experimentales en el campo de la cinética enzimática y la termodinámica química. En nuestro laboratorio trabajamos con diversas técnicas biofísicas y bioquímicas. Entre las más frecuentemente utilizadas se hallan las titulaciones espectroscópicas y calorimétricas de unión de ligandos en equilibrio, y el empleo de equipamiento de ´stopped-flow` y ´quenched-flow` para estudios cinéticos de reacciones en régimen pre-estacionario.

J. Jeremías Incicco- IQUIFyB. Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA)
Mehrnoosh Arrar – CONICET – Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)
Leopoldo Gebhard – CONICET at Universidad Nacional de Quilmes.
Andrea V. Gamarnik – CONICET. Instituto Leloir
F. Luis González-Flecha – CONICET- IQUIFyB. Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA)